如何培養CMECs大鼠心肌微血管內皮細胞

一、細胞培養條件

二、細胞收到后處理

培養至良好狀態后灌滿培養液并封好瓶口是運輸細胞的最好辦法。收到細胞用75%酒精噴灑整個細胞瓶，消毒后放到超凈臺內嚴格無菌操作，將細胞瓶放入37℃、5%CO₂的培養箱中靜置3-4小時以穩定細胞狀態后再做處理。顯微鏡觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數拍照保存（最好40x,100x,200x各一張），前三天照片是重要售后依據，不提供照片默認收到狀態良好。（注意密封培養瓶放入培養箱時要將蓋子擰松，傳代后建議一瓶用原瓶的培養基，另外一瓶用自己配的培養基，以便進行對比培養）

三、細胞培養步驟

a、細胞傳代：如果未超過80%匯合度時，將瓶裝的培養液收集至離心管中，留5ml培養基，放入37℃、5%CO₂孵箱培養；如果細胞密度超80%，即可進行傳代培養，傳代具體步驟如下：

1. 棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液約1-2ml至培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加5ml以上培養基終止消化。

3.輕輕吹打細胞，使之脫落后吸出，然后將懸液轉移至15ml離心管中，在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養基重懸。

4. 將細胞懸液按1：2的比例進行分瓶傳代（兩個T25瓶），補充新的培養基至5-8ml/瓶，最后放入到37℃、5%CO₂的細胞培養箱中培養。

b、細胞凍存：

1、細胞生長至覆蓋培養瓶的80%面積時，棄T25培養瓶中的培養液，用PBS清洗細胞一次；

2、添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后加入5ml培養液終止消化，再輕輕吹打細胞使之脫落，然后將懸液轉移至15ml離心管中，1000rpm離心 5min；

3、 棄上清，沉淀細胞加入1ml的雅吉生物無血清凍存液（貨號：C7001），混勻后加入凍存管中。

4、 將凍存細胞直接放入-80℃冰箱即可，如后期要將細胞轉入液氮罐中，則需在-80℃冰箱 中存放24小時以上再轉入液氮罐中。

C、細胞復蘇：

1、從液氮中取出細胞凍存管（注意佩戴防護面具），快速將其置入 37℃水浴中解凍， 直至凍存管中無結晶，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；

2、將凍存管中的細胞移至含 5ml 培養基的15ml離心管中，1000rpm離心5min；

3、棄上清，沉淀用5ml培養基重懸，接種至T25培養瓶，放于37℃,5%CO₂細胞培養箱中培養；

4、第二天，換用新鮮培養基繼續培養。

四、注意事項：有些細胞比較特殊，如貼壁不牢，在運輸過程中發生容易細胞脫落，這是正?，F象。請將培養瓶所有培養液收集至離心管，1000rpm離心5min，收集上清作過渡培養（后期對比培養），沉淀加入胰酶1-2ml，輕輕吹打，重懸，消化1-2分鐘后，加5ml培養基終止反應。再離心，棄上清，加1-2ml培養基重懸。然后按1:2比例進行分瓶傳代（兩個T25），補充新的培養基至5-8ml/瓶，最后放入37℃,5%CO₂細胞培養箱中培養。

五、售后條款：

1）細胞出現問題，可重發的情況有哪些？判定標準是什么？

1. 細胞運輸途中遭遇的各種問題，細胞丟失、瓶身破損、培養液嚴重漏液等，重發；

2. 細胞污染問題，請在收到產品48小時內，給我們提出真實的實驗結果，核實后重發；

3. 常溫發貨的細胞靜置24小時后，干冰凍存發貨的細胞復蘇后24小時后，絕大多數細胞未存活，（需提供真實清晰的細胞狀態照片），重發；

4. 干冰凍存發貨的細胞復蘇后24小時后或常溫發貨的細胞靜置4小時候并且未開封，出現污染，重發；

5. 細胞活性問題，請在收到產品7天內給我們提出真實的實驗結果，用臺盼藍染色法鑒定細胞活力，核實后予重發；

6. 細胞收到當天以及第2,3天請拍照，3天未告知的，視為產品合格。4-7天內出現問題有提供收到細胞前3天照片和細胞出現問題時照片以及細胞相關操作的詳細步驟的，并跟技術人員溝通的，由技術人員判定為我方責任的，重發。技術人員判定為雙方承擔責任的由雙方進行協商處理或者按合同價的50%收費重發。

2）細胞出現問題，不予以重發的情況有哪些？

1. 客戶造成細胞污染，不重發；

2. 客戶不正確操作致細胞狀態不好，不重發；

3. 非本庫推薦細胞培養體系致的細胞狀態不好，不重發；

4. 細胞狀態不好，未提供細胞培養前3天照片的，不重發；

5. 細胞培養時經其它處理的，不重發；

6. 細胞收到2天內，未告知，不重發；

7. 視具體情況而定。

如何培養CMECs大鼠心肌微血管內皮細胞