詳細介紹
堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,簡稱ALP或AKP)為一類磷酸酯酶,廣泛分布于哺乳動物組織內,其活性所需最適pH 9.2~9
.8。此酶主要存在于物質交換活躍之處(細胞膜),如腸上皮和腎近曲小管的刷狀緣、附睪上皮之靜纖毛、肝的毛細膽管膜以及
微動脈和毛細血管動脈部之內皮,還見于內質網、高爾基復合體、吞飲小泡、腸上皮之溶酶體、中性粒細胞之中性顆粒以及
平滑肌的細胞膜。
堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒(PNP比色法)(Alkaline Phosphatase Colorimetric Assay Kit)采用PNP比色法,其檢測原理是
Para-nitrophenyl phosphate (pNPP)為一種常用的磷酸酶顯色底物,在酸性條件下,可在堿性磷酸酶的作用下生成
p-nitrophenol;在堿性條件下p-nitrophenol轉變成醌式結構,呈較深的黃色,產物黃色越深說明堿性磷酸酶活性越高,
反之則酶活性越低,通過比色法(酶標儀)測定400~415nm處吸光度,據此通過比色分析就可以計算出堿性磷酸酶活性水平
,可用于檢測細胞或組織的裂解液或勻漿液、血漿、血清、尿液等樣品中內源性的堿性磷酸酶活性。該試劑盒僅用于科研領域
,不適用于臨床診斷或其他用途。
操作步驟(僅供參考):
1、取內徑為8mm的玻璃試管2支,分別加入白陶土-腦磷脂混懸液0.2ml。
2、靜脈采血1ml,立即取下針頭,沿管壁向各試管注入血液0.5ml,立即混勻并啟動秒表計時,并置于37℃水浴中。
3、每隔10s輕搖試管一次,觀察管內血液流動情況,直至血液凝固。記錄血液凝固所需時間,即為ACT。
4、取2支試管血液凝固時間的平均值作為ACT 值。
計算:參考區間: (1.77±0.76)min
4、配制標準品工作液︰如果檢測血清、尿液等樣品,按取丙酮酸標準(6mg/ml):蒸餾水=1:99的比例配制,使濃度達到60μg/ml,如果檢測組織樣品按丙酮酸標準(6mg/ml) :組織勻漿液(1×)=1:99的比例配制,使濃度達到60μg/ml。
注意事項:
1、實驗材料應盡量新鮮,如取材后不立即使用,應存于-20°C.
2、實驗用蒸餾水不能含有二氧化碳,可用新煮沸且冷卻后的蒸餾水,并蓋緊口。
3、TA滴定液為堿性溶液,有腐蝕性,請小心操作。
4、TA標定液容易長菌,宜4℃保存,一旦發現有絮狀物請棄用。
5、果實中含酸量較少時可將TA滴定液適當稀釋后使用,可考慮用0.01~0.05M TA滴定液進行滴定。
6、TA滴定液含量計算公式中,V0最好為3次空白測定的平均值。
7、如果所測樣品的濃度過高,應用TA Lysis Buffer工作液稀釋樣品后重新測定,并將稀釋倍數帶入公式。
8、如果樣品顏色較深,滴定終點不易觀察,應采用電位滴定法。
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